本发明提供了一种可用作免疫佐剂的改良型鞭毛蛋白及其制备与应用。本发明的鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白突变体，具有鞭毛蛋白的生物活性，与野生型鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白相比，含有I411A突变。本发明的鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白突变体可使TLR5介导的天然免疫应答减弱，且具有显著的佐剂活性。
1.一种鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白突变体，具有鞭毛蛋白的生物活性，与野生型鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白相比，含有I411A突变。
2.如权利要求1所述鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白突变体，其特征在于，相比野生型鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白，所述鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白突变体对Toll样受体5的刺激活性减弱。
3.如权利要求1所述鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白突变体，其特征在于，所述鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白突变体的氨基酸序列为：SEQxa0IDxa0NO:5。
4.一种多核苷酸，其编码权利要求1-3任一权利要求所述鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白突变体。
5.如权利要求4所述多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸序列为：SEQxa0IDxa0NO:6。
6.一种表达载体，其含有权利要求4或5所述多核苷酸。
7.一种宿主细胞，其被权利要求6所述表达载体所转化。
8.如权利要求7所述宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为沙门菌。
9.权利要求1-3任一权利要求所述鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白突变体的制备方法，包括下列步骤：1）将所述鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白突变体的基因克隆入fliC基因与fljB基因双缺失的鼠伤寒沙门菌，并在合适条件下培养所述鼠伤寒沙门菌，使得鞭毛蛋白在其菌体表面表达；2）从培养物中分离出所述鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白突变体。
10.如权利要求1-3任一权利要求所述鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白突变体在制备疫苗中的用途。
11.如权利要求10所述的用途，其特征在于，所述鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白突变体在制备疫苗时，用作免疫佐剂。
12.一种疫苗佐剂，其佐剂活性成分含有权利要求1-3任一权利要求所述鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白突变体。
13.一种疫苗，包括权利要求1-3任一权利要求所述鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白突变体以及一种或多种抗原。技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种可用作免疫佐剂的改良型鞭毛蛋白及其制备与应用。
背景技术
鞭毛蛋白含有494个氨基酸，具有4个球形结构域（D0，D1，D2和D3），其中D0和D1结构域高度保守。来自各类细菌的鞭毛蛋白的氨基酸序列可在NCBIxa0GenBank数据库中获得。其中，已知来自鼠伤寒沙门菌I(S.Typhimuriumxa01)、幽门螺杆菌(H.Pylori)、霍乱弧菌(V.Cholera)、粘质沙雷氏菌(S.marcesens)、福氏痢疾杆菌(S.flexneri)、梅毒螺旋体(T.Pallidum)、嗜肺军团菌(L.pneumophila)、伯氏疏螺旋体(B.burgdorferei)、艰难梭状芽孢杆菌(C.difficile)、苜蓿根瘤菌(R.meliloti)、根癌农杆菌(A.tumefaciens)、羽扇豆根瘤菌(R.lupini)、卡氏巴尔通体(B.clarridgeiae)、奇异变形杆菌(P.Mirabilis)、枯草杆菌(B.subtilus)、单核细胞增生李斯特菌(L.monocytogenes)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)和大肠杆菌(E.coli)的鞭毛蛋白序列。鞭毛蛋白具有佐剂效应，但其产生佐剂效应的机制还不清楚。研究表明，鞭毛蛋白通过与宿主细胞的TLR5受体结合，刺激细胞产生大量的促炎性细胞因子从而激发佐剂效应。然而最近的研究发现，鞭毛蛋白与卵清白蛋白（OVA）混合免疫TLR5^(-/-)小鼠后，其诱导OVA蛋白体液免疫应答的佐剂能力没有发生变化，从而推断TLR5介导的天然应答不是鞭毛蛋白产生佐剂效应的必需条件。另外，鞭毛蛋白作用于TLR5受体后，激发产生的强烈天然免疫应答会导致系统性不良反应，如脓毒症等。鞭毛蛋白对机体的副作用制约了其作为佐剂的应用前景。因此，亟需研究开发出一种改良型鞭毛蛋白，该蛋白既能保留野生型鞭毛蛋白免疫佐剂的特点，同时又能降低其激发的天然免疫应答，减轻其对机体的副作用，这对于新型疫苗研发具有现实意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种改良型鞭毛蛋白及其制备与应用，该蛋白既能保留野生型鞭毛蛋白免疫佐剂的特点，同时又能降低其激发的天然免疫应答，减轻其对机体的副作用，使鞭毛蛋白作为佐剂具有高度的安全性。本发明一方面提供了一种鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白突变体，具有鞭毛蛋白的生物活性，与野生型鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白相比，含有I411A突变（鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白fliC基因第411位上的异亮氨酸（I411）定点突变成丙氨酸（A））。进一步的，所述鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白突变体具有免疫佐剂活性。相比野生型鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白，对Toll样受体5（Toll-like5,TLR5）的刺激活性减弱。进一步的，本发明所述鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白突变体的氨基酸序列为：SEQxa0IDxa0NO:5MAQVINTNSLSLLTQNNLNKSQSALGTAIERLSSGLRINSAKDDAAGQAIANRFTANIKGLTQASRNANDGISIAQTTEGALNEINNNLQRVRELAVQSANSTNSQSDLDSIQAEITQRLNEIDRVSGQTQFNGVKVLAQDNTLTIQVGANDGETIDIDLKQINSQTLGLDTLNVQQKYKVSDTAATVTGYADTTIALDNSTFKASATGLGGTDQKIDGDLKFDDTTGKYYAKVTVTGGTGKDGYYEVSVDKTNGEVTLAGGATSPLTGGLPATATEDVKNVQVANADLTEAKAALTAAGVTGTASVVKMSYTDNNGKTIDGGLAVKVGDDYYSATQNKDGSISINTTKYTADDGTSKTALNKLGGADGKTEVVSIGGKTYAASKAEGHNFKAQPDLAEAAATTTENPLQKADAALAQVDTLRSDLGAVQNRFNSAITNLGNTVNNLTSARSRIEDSDYATEVSNMSRAQILQQAGTSVLAQANQVPQNVLSLLR.本发明第二方面提供了一种多核苷酸，其编码所述鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白突变体。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。进一步的，所述多核苷酸序列为：SEQxa0IDxa0NO:6ATGGCACAAGTCATTAATACAAACAGCCTGTCGCTGTTGACCCAGAATAACCTGAACAAATCCCAGTCCGCTCTGGGCACCGCTATCGAGCGTCTGTCTTCCGGTCTGCGTATCAACAGCGCGAAAGACGATGCGGCAGGTCAGGCGATTGCTAACCGTTTTACCGCGAACATCAAAGGTCTGACTCAGGCTTCCCGTAACGCTAACGACGGTATCTCCATTGCGCAGACCACTGAAGGCGCGCTGAACGAAATCAACAACAACCTGCAGCGTGTGCGTGAACTGGCGGTTCAGTCTGCTAACAGCACCAACTCCCAGTCTGACCTCGACTCCATCCAGGCTGAAATCACCCAGCGCCTGAACGAAATCGACCGTGTATCCGGCCAGACTCAGTTCAACGGCGTGAAAGTCCTGGCGCAGGACAACACCCTGACCATCCAGGTTGGTGCCAACGACGGTGAAACTATCGATATCGATCTGAAGCAGATCAACTCTCAGACCCTGGGTCTGGATACGCTGAATGTGCAACAAAAATATAAGGTCAGCGATACGGCTGCAACTGTTACAGGATATGCCGATACTACGATTGCTTTAGACAATAGTACTTTTAAAGCCTCGGCTACTGGTCTTGGTGGTACTGACCAGAAAATTGATGGCGATTTAAAATTTGATGATACGACTGGAAAATATTACGCCAAAGTTACCGTTACGGGGGGAACTGGTAAAGATGGCTATTATGAAGTTTCCGTTGATAAGACGAACGGTGAGGTGACTCTTGCTGGCGGTGCGACTTCCCCGCTTACAGGTGGACTACCTGCGACAGCAACTGAGGATGTGAAAAATGTACAAGTTGCAAATGCTGATTTGACAGAGGCTAAAGCCGCATTGACAGCAGCAGGTGTTACCGGCACAGCATCTGTTGTTAAGATGTCTTATACTGATAATAACGGTAAAACTATTGATGGTGGTTTAGCAGTTAAGGTAGGCGATGATTACTATTCTGCAACTCAAAATAAAGATGGTTCCATAAGTATTAATACTACGAAATACACTGCAGATGACGGTACATCCAAAACTGCACTAAACAAACTGGGTGGCGCAGACGGCAAAACCGAAGTTGTTTCTATTGGTGGTAAAACTTACGCTGCAAGTAAAGCCGAAGGTCACAACTTTAAAGCACAGCCTGATCTGGCGGAAGCGGCTGCTACAACCACCGAAAACCCGCTGCAGAAAGCTGATGCTGCTTTGGCACAGGTTGACACGTTACGTTCTGACCTGGGTGCGGTACAGAACCGTTTCAACTCCGCTATTACCAACCTGGGCAACACCGTAAACAACCTGACTTCTGCCCGTAGCCGTATCGAAGATTCCGACTACGCGACCGAAGTTTCCAACATGTCTCGCGCGCAGATTCTGCAGCAGGCCGGTACCTCCGTTCTGGCGCAGGCGAACCAGGTTCCGCAAAACGTCCTCTCTTTACTGCGTTAA本发明第三方面提供了一种表达载体，其含有前述多核苷酸。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建所述表达载体。这些方法包括重组DNA技术、DNA合成技术等。可将编码所述鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白突变体的DNA有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成，进而表达蛋白。较佳的，所述表达载体为原核载体。进一步的，所述原核载体可在沙门菌内稳定复制，如原核载体pTrc99a、pYA3333、pYA3334等。本发明第四方面提供了一种宿主细胞，其被前述表达载体所转化。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有:大肠杆菌，链霉菌属;鼠伤寒沙门菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO,COs.293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。其中，特别优选沙门菌，如LB5000、ATCC14028s、X4550、SL5928、SL1438等。本发明第五方面提供了所述鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白突变体的制备方法，包括下列步骤：1）将所述鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白突变体的基因克隆入fliC基因与fljB基因双缺失的鼠伤寒沙门菌，并在合适条件下培养所述鼠伤寒沙门菌，使得鞭毛蛋白在其菌体表面表达；2）从培养物中分离出所述鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白突变体。从培养物中分离出具有鞭毛蛋白的生物活性的蛋白的方法可采用酸裂解法提取。本发明第六方面，提供了所述鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白突变体在制备疫苗中的用途。进一步的，所述鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白突变体在制备疫苗时，用作免疫佐剂。本发明第七方面，提供了一种疫苗佐剂，其佐剂活性成分含有所述鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白突变体。进一步的，所述疫苗佐剂还包括药学上可接受的载体或赋形剂。本领域枝术人员已知的治疗惰性的无机或有机的载体或赋形剂包括(但不限于)乳糖、玉米淀粉或其衍生物、滑石、植物油、蜡、脂肪、多羟基化合物例如聚乙二醇、水、蔗糖、乙醇、甘油，诸如此类，各种防腐剂、润滑剂、分散剂、矫味剂。保湿剂、抗氧化剂、甜味剂、着色剂、稳定剂、盐、缓冲液诸如此类也可加入其中，这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味。本发明第八方面，提供了一种疫苗，包括所述鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白突变体以及一种或多种抗原。有多种物质可用作疫苗中的抗原。例如，减毒的和灭活的病毒和细菌病原体、纯化的大分子、多糖、类毒素、重组抗原、含有来自病原体的外来基因的生物体、合成的肽、聚核酸、抗体和肿瘤细胞等。本发明的鞭毛蛋白可使TLR5介导的天然免疫应答减弱，且具有显著的佐剂活性，可用作其它旁观蛋白（bystanderxa0protein）的免疫佐剂。
附图说明
图1xa0xa0重组质粒pMD18T-fliC-WT的酶切鉴定结果M1.λ-EcoT14xa0digestxa0Marker;M2.DL2000xa0DNAxa0Marker;1.pMD18T-fliC-WT/NcoⅠ+HindIII.图2xa0xa0重组质粒pMD18T-fliC-411的酶切鉴定结果M1.λ-EcoT14xa0digestxa0Marker;M2.DL2000xa0DNAxa0Marker;1.pMD18T-fliC-411/NcoⅠ+HindIII.图3xa0xa0pTrc99a-fliC-WT和pTrc99a-fliC-411的酶切鉴定结果M1.λ-EcoT14xa0digestxa0Marker;M2.DL2000xa0DNAxa0Marker;1.pTrc99a-fliC-WT/NcoⅠ+HindIII；2.pTrc99a-fliC-411/NcoⅠ+HindIII.图4xa0xa0Westernxa0blot分析各重组沙门菌鞭毛蛋白M.Proteinxa0marker;1.ATCC14028sxa0(pTrc99a-fliC-WT)flagellin;2.ATCC14028s(pTrc99a-fliC-411)flagellin.图5．pTrc99a-fliC-411鞭毛蛋白诱导IL-8的检测结果图6．pTrc99a-fliC-411鞭毛蛋白激活NF-κB检测结果图7．pTrc99a-fliC-411鞭毛蛋白诱导IL-1β的检测结果图8．pTrc99a-fliC-411鞭毛蛋白免疫佐剂效应检测结果
具体实施方式
本发明所述的改良型鞭毛蛋白的表达，是将fliC基因411位氨基酸I→A突变，并克隆至原核表达载体pTrc99a，经中间宿主LB5000转化至终末宿主ATCC14028s(fliC^-fljB^-)。宿主菌经IPTG诱导后，可在细菌表面长出重组鞭毛。经酸裂解法提取，可得到高纯度鞭毛蛋白突变体，此鞭毛蛋白突变体具有天然鞭毛蛋白的空间构象与生物活性。其激发的天然免疫应答降低，如NF-κB反应，IL-8、IL-1β等炎性细胞因子分泌减少，该蛋白与OVA蛋白混合免疫小鼠后，其佐剂效应得到完全保留，说明这种改良型鞭毛蛋白具有重要的基础研究和实际应用价值。在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULARxa0CLONING：Axa0LABORATORYxa0MANUAL，Secondxa0edition，Coldxa0Springxa0Harborxa0Laboratoryxa0Press，1989andxa0Thirdxa0edition，2001；Ausubel等，CURRENTxa0PROTOCOLSxa0INxa0MOLECULARxa0BIOLOGY，Johnxa0Wileyxa0&xa0Sons，Newxa0York，1987andxa0periodicxa0updates；thexa0seriesxa0METHODSxa0INxa0ENZYMOLOGY，Academicxa0Press，Sanxa0Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURExa0ANDxa0FUNCTION，Thirdxa0edition，Academicxa0Press，Sanxa0Diego，1998；METHODSxa0INxa0ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarmanxa0andxa0A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，Sanxa0Diego，1999；和METHODSxa0INxa0MOLECULARxa0BIOLOGY，Vol.119，Chromatinxa0Protocols(P.B.Becker，ed.)Humanaxa0Press，Totowa，1999等。实施例1一、鼠伤寒沙门菌fliC基因的克隆与重组质粒构建将鞭毛蛋白fliC基因411位氨基酸I→A定点突变，突变的fliC基因插入原核表达载体pTrc99a中，构建成重组质粒pTrc99a-fliC-411。1.引物的设计与基因扩增参照GenBank中鼠伤寒沙门菌ATCC14028sxa0DNA序列设计引物，上游引物为5'-ATACCATGGCACAAGTCATTAAT-3'（SEQxa0IDxa0NO：1），下游引物为5'-TCAAAGCTTAACGCAGTAAAGAGAG-3'（SEQxa0IDxa0NO：2），上下游引物分别带有Ncoxa0Ⅰ和HindIII位点，上游引物中包含了起始密码子ATG，下游引物包含了fliC基因终止密码子。从鼠伤寒沙门菌ATCC14028s中提取基因组为模板，以SEQxa0IDxa0NO：1和SEQxa0IDxa0NO：2的序列为扩增引物，用高保真酶PCR扩增fliC基因片段，片段大小为1485xa0bp，将扩增的fliC基因片段PCR产物回收后与pMD18T载体（TaKaRa公司）4℃过夜连接，连接产物转化DH5α感受态细菌，氨苄青霉素抗性筛选，双酶切鉴定（图1）。鉴定正确的重组质粒命名为pMD18T-fliC-WT。2．重组质粒pMD18T-fliC-411的构建与鉴定设计一对引物，上游引物：5'-GACxa0TATxa0AAGxa0GACxa0GATxa0GATxa0GACxa0AAAxa0TA-3'（SEQxa0IDxa0NO：3），下游引物：5'-AGCTTTCTGCAGCGGGTTTT-3'（SEQxa0IDxa0NO：4），应用TaKaRaxa0MutanBESTxa0Kit扩增pMD18T-fliC-WT质粒，获得fliC基因411位氨基酸I→A突变的基因片段fliC-411。将fliC-411基因片段与pMD18T载体4℃过夜连接，连接产物转化DH5α感受态细菌，氨苄青霉素抗性筛选，双酶切鉴定（图2），鉴定正确的重组质粒命名为pMD18T-fliC-411。3．重组质粒pTrc99a-fliC-WT和pTrc99a-fliC-411的构建与鉴定用Ncoxa0Ⅰ和HindIII双酶切重组质粒pMD18T-fliC-WT、pMD18T-fliC-411及载体pTrc99a，经过电泳、切胶回收后，T4DNA连接酶4℃过夜连接，连接产物转化DH5α感受态细菌，氨苄青霉素抗性筛选，双酶切鉴定（图3），鉴定正确的重组质粒命名为pTrc99a-fliC-WT和pTrc99a-fliC-411。二、ATCC14028s(pTrc99a-fliC-WT)和ATCC14028s(pTrc99a-fliC-411)重组鼠伤寒沙门菌的构建及其鞭毛蛋白的提取采用电转化法将重组质粒pTrc99a-fliC-WT或pTrc99a-fliC-411转化至中间宿主菌LB5000获得修饰后，再转化至终末宿主菌ATCC14028s(fliC^-fljB^-)(fliC基因与fljB基因双缺失）。1.LB5000(pTrc99a-fliC-WT)、LB5000(pTrc99a-fliC-411)重组鼠伤寒沙门菌和ATCC14028s(pTrc99a-fliC-411)、ATCC14028s(pTrc99a-fliC-411)重组鼠伤寒沙门菌的构建LB5000：美国Lomaxa0Linda大学ATCC14028s(fliC^-fljB^-)：美国Universityxa0ofxa0Washington大学。可参照Smithxa0KD,Andersen-Nissenxa0E,Hayashixa0F,Strobexa0K,Bergmanxa0MA,Barrettxa0SL,Cooksonxa0BT,Aderemxa0A(2003)Toll-likexa0receptorxa05xa0recognizesxa0axa0conservedxa0sitexa0onxa0flagellinxa0requiredxa0forxa0protofilamentxa0formationxa0andxa0bacterialxa0motility.Natxa0Immunol4(12):1247-1253文献制备。以小提质粒试剂盒分别提取DH5α中的pTrc99a-fliC-WT和pTrc99a-fliC-411质粒，用电穿孔法分别将上述重组质粒导入LB5000沙门菌感受态细胞，转化菌涂布于含100μg/mL氨苄青霉素抗性LB平板进行筛选；挑取单个菌落提取质粒，并进行测序鉴定，将鉴定正确的重组菌命名为LB5000(pTrc99a-fliC-411)和LB5000(pTrc99a-fliC-411)。以小提质粒试剂盒分别提取中间宿主LB5000沙门菌中的pTrc99a-fliC-WT和pTrc99a-fliC-411质粒，用电穿孔法分别将重组质粒导入ATCC14028s(fliC^-fljB^-)沙门菌感受态细胞，转化菌涂布于含100μg/mL氨苄青霉素抗性LB平板进行筛选；挑取单个菌落提取质粒，并进行测序鉴定，将序列符合预期，鉴定正确的重组菌命名为ATCC14028s(pTrc99a-fliC-WT)和ATCC14028s(pTrc99a-fliC-411)。2.ATCC14028s(pTrc99a-fliC-WT)和ATCC14028s(pTrc99a-fliC-411)重组鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白的提取与Westernxa0blot分析结果各重组沙门菌鞭毛蛋白的提取程序为：接种各重组沙门菌至含1mMxa0IPTG和100μg/mL氨苄青霉素的5mLxa0M-broth中，37℃静置培养16-18h后，以1:100扩大培养16-18h。500×g离心20min，收集菌体，加入5mL灭菌PBS重悬，用1Nxa0HCl将菌悬液pH值调至2.0-3.0,分装2mLeppendorf管5管，每管1mL，室温150rpm振荡30min。4℃4000rpm离心10min，收集上清后分别在8000rpm、10000rpm和12000rpm继续离心5min收获上清，再用1Nxa0NaOH将上清pH调至7.2，在PBS缓冲液中4℃透析24h，每隔6h换一次PBS缓冲液。应用ProteoSpin^TMxa0Endotoxinxa0Removalxa0Maxi试剂盒和Piercexa0High-Capacityxa0Endotoxinxa0Removalxa0Spin去内毒素柱去除所提取鞭毛蛋白的内毒素，内毒素最终浓度低于0.1EU/μg蛋白，对提取的各重组沙门菌鞭毛蛋白进行Westernxa0blot分析：经SDS-PAGE电泳后，将蛋白转印到PVDF膜上，用含10％BSA的PBST4℃作用12h；PBST洗涤3次后，再与Hi单因子诊断血清（1:500稀释）作用2h，充分洗涤后以HRP标记的羊抗兔IgG作为二抗（1:1000稀释）作用1h，PBST洗涤3次后，DAB显色，蒸馏水终止反应。Westernxa0blot结果表明，ATCC14028s(pTrc99a-fliC-WT)和ATCC14028s(pTrc99a-fliC-411)重组沙门菌鞭毛蛋白均能够与兔抗Hi单因子诊断血清发生特异性反应，蛋白大小均约为52KD（图4）。三、鞭毛蛋白突变体激发天然免疫应答能力的测定1.鞭毛蛋白突变体激活TLR5的检测在96孔培养板中每孔加200μLxa0293-mTLR5细胞（Invivogen公司）悬液，50，000个细胞/孔。37°C，5%CO₂过夜培养。用10倍系列稀释终浓度为0.1ng-100ng的pTrc99a-fliC-WT或pTrc99a-fliC-411鞭毛蛋白刺激，刺激5h后吸取上清以测量IL-8含量。BDxa0OptEIA^TMxa0Setxa0Mousexa0IL-8ELISA步骤如下：在ELISA板上每孔包被100μL已稀释的IL-8单克隆捕捉抗体（BD公司），4°C包被过夜；用0.05%PBST洗板3次后，以200μL封闭液在室温封闭1h；同法洗板3次后，每孔加入100μL标准品或样品，在室温作用2h；同法洗板5次后，每孔加入100μL检测工作试剂（IL-8单克隆检测抗体）+SAV-辣根过氧化物酶，BD公司），室温作用1h；同法洗板7次后，每孔加入100μL底物缓冲液，在暗处室温作用30min；最后每孔加入50μL2Nxa0H₂SO₄终止液。于30min内在OD450nm测量波长与OD570nm参比波长中读数。结果如图5所示，pTrc99a-fliC-411激活TLR5能力要弱于野生型鞭毛蛋白。2.鞭毛蛋白突变体对NF-κB激活检测质粒pNiFty-SEAP转染293-mTLR5细胞。根据LyoVec^TM提供的技术说明制备pNiFty_-SEAP/LyoVec^TM复合物，在96孔平板上每孔200μL铺50，000个细胞，每孔加入10μLpNiFty(2)-SEAP/LyoVec^TM复合物转染；37°C，5%CO₂培养24h。鞭毛蛋白刺激。先小心吸去培养基，每孔加入180μL新鲜的生长培养基。加入20μL鞭毛蛋白，终浓度为500pg/mL，并设阳性对照和阴性对照；37°C，5%CO₂培养20h。SEAP定量检测。向96孔板中加入QUANTI-Blue^TM检测溶液，180μL/孔，再加入上述鞭毛蛋白刺激293-mTLR5细胞的培养上清，20μL/孔；37°C，5%CO₂培养2h；测量OD630nm吸光值，确定SEAP值。结果如图6所示，fliC-411鞭毛蛋白较野生型鞭毛蛋白的NF-κB激活能力有显著减弱。3.鞭毛蛋白诱导小鼠腹腔渗出细胞（peritonealxa0exudatexa0cell，PEC）分泌IL-1β炎性细胞因子的检测按常规方法制备小鼠PEC，以2×10⁵个细胞/200μL//孔加入96孔板中，37°C，5%CO₂培养2h后，吸弃上清，用预热的RPMI1640培养基洗2次，留下贴壁细胞。在5%CO₂，37℃条件下，均以各鞭毛蛋白终浓度为10μg/mL刺激PECxa024h，同时设立PBS对照。吸取上清，ELISA检测IL-1β含量。BDxa0OptEIA^TMxa0Setxa0Mousexa0IL-1βELISA步骤如下：在ELISA板上每孔包被100μL已稀释IL-1β单克隆捕捉抗体（BD公司），4°C包被过夜；用0.05%PBST洗板3次后，以200μL封闭液在室温封闭1h；同法洗板3次后，每孔加入100μL标准品或样品，在室温作用2h；同法洗板5次后，每孔加入100μLxa0IL-1β单克隆检测抗体（BD公司）在室温作用1h；同法洗板5次后，每孔加入100μL已稀释的SAV-HRP，在室温作用30min；同法洗板7次后，每孔加入100μL底物缓冲液，在暗处室温作用30min；最后每孔加入50μL2Nxa0H₂SO₄终止液，在OD450nm测量波长与OD570nm参比波长中读数。结果如图7所示，pTrc99a-fliC-411鞭毛蛋白与其野生型鞭毛蛋白相比，其诱导巨噬细胞分泌IL-1β的能力降低。四、鞭毛蛋白突变体的免疫佐剂活性将6-8周龄雌性C57BL/6小鼠分为4组，每组5只，分别为野生型鞭毛蛋白（pTrc99a-fliC-WT）+OVA免疫组、鞭毛蛋白突变体（pTrc99a-fliC-411）+OVA免疫组，OVA对照组和空白对照组。免疫途径为腹腔注射（ip），免疫分两次进行，首免后第14天进行二免。pTrc99a-fliC-WT+OVA免疫组：pTrc99a-fliC-WT0.5μg+OVA50μg，pTrc99a-fliC-411+OVA免疫组：pTrc99a-fliC-4110.5μg+OVA50μg，OVA蛋白免疫组：50μg，PBS空白对照组：200μL。二免后第10天眼眶静脉采血，收集血清样品。以OVA蛋白每孔1μg包被酶标板，检测待检血清中OVA蛋白特异性IgG抗体。结果如图8所示，鞭毛蛋白突变体（pTrc99a-fliC-411）佐剂活性与野生型鞭毛蛋白（pTrc99a-fliC-WT）相当。以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。 ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="438"/> ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="441"/> ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="386"/> ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="388"/> ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="386"/> ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="440"/> ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>